适配体筛选新策略：SELEX+NGS实现适配体高精准、高通量！

 

一、SELEX适配体筛选原理

 

指数富集配体的系统进化（SELEX）技术是体外筛选高亲和力、高特异性核酸适配体（Aptamer）的核心技术。其基本原理是从包含海量随机序列的寡核苷酸文库中逐轮富集并鉴定出特定的核酸序列，这些序列能够与特定靶标分子（如蛋白质、小分子、细胞等）发生特异性结合，进而获得能像抗体一样精准识别靶标的核酸分子工具。

SELEX适配体筛选过程完全在体外进行，不会受到物种限制，可实现针对非免疫原性、毒性等多种靶标的高效筛选。在筛选过程中，研究人员可以通过控制筛选压力，如洗涤强度、引入负筛以去除与非靶标结构的非特异性结合，可精细调控所获得适配体的亲和力与特异性，为下游应用奠定基础。

 

图1 Cell-SELEX筛选流程图（源于[1]）

 

二、下一代SELEX测序技术

 

传统SELEX技术，通常依赖于克隆测序来获得少数代表性序列，这种方法成本高、通量低，而且极易导致筛选结果中遗漏丰度较低但性能优异的潜在适配体，使得筛选的整体效率与成功率下降。下一代测序（NGS）技术，通常对筛选过程中每一轮的整个核酸文库进行深度的序列测定，从而获取海量的序列丰度与分布数据。将NGS深度整合到SELEX适配体筛选流程中，就形成了下一代SELEX测序策略。其核心在于通过测定连续轮次富集文库的全序列信息，可以定量追踪每一个独特序列在筛选过程中的丰度变化轨迹。那些随轮次增加而频率显著上升的序列簇，被识别为关键候选者，从而客观高效地挖掘出高潜力适配体。

 

三、RNA适配体筛选策略

 

与DNA适配体相比较，RNA适配体拥有更加丰富的空间结构（如假结、凸环、G-四链体）和构象灵活性，通常能与靶标产生更高亲和力及特异性的相互作用，在治疗诊断领域应用前景广阔。然而，RNA分子因其固有的化学与酶学不稳定性，研究人员需在传统SELEX框架内引入针对性优化。RNA适配体筛选策略包括：

（1）构建稳定RNA文库：在构建起始RNA文库时，需要在体外转录过程中掺入经过化学修饰的核苷酸，以形成稳定的RNA文库进行后续筛选。

（2）维持RNA完整性：使用RNase抑制剂、DEPC处理的水和缓冲液，并将操作环境与潜在RNase污染源隔离，严格优化实验操作。

（3）高效的逆转录（RT）：优化能够高效读取此类修饰模板的逆转录酶，以确保信息从RNA到互补DNA（cDNA）的准确、完整传递，避免序列信息的丢失。此外，增加筛选压力以富集得到皮摩尔甚至飞摩尔级亲和力的适配体。

 

四、适配体RNA测序优化

 

与DNA-SELEX不同，RNA-SELEX的测序起点是不稳定的单链RNA，其转化为高质量NGS文库的过程更为复杂且易引入偏差，直接影响数据的可靠性与筛选效率。RNA适配体测序主要通过测序文库构建和生物信息学分析流程方面进行优化：

（1）测序文库构建的优化：通过使用能够耐受常见修饰的逆转录酶，以较大程度减少序列信息丢失的概率；精确控制PCR扩增的循环数以防过度扩增导致某些序列会被过度放大或产生嵌合体问题。

（2）生物信息学分析流程的优化：通过分析预测这些序列家族的丰度动力学及二级结构可以更准确地锁定那些因具有稳定、特定空间构象而被强力富集的功能性RNA适配体候选簇，从而超越单纯依赖序列丰度的传统分析方法。

 

五、SELEX测序应用展望

 

随着SELEX测序技术不断成熟，适配体筛选的应用前景正从传统领域向更广阔的生物医学前沿拓展：

（1）新型诊断与治疗工具开发领域：NGS-SELEX结合单细胞测序技术，可筛选出区分疾病不同阶段的“精准适配体”，广泛应用于液体活检、体内成像或靶向递药系统。

（2）基础分子互作研究：为了缩短研发周期，研究人员通过对筛选过程中产生的超大规模序列-功能数据进行深度挖掘，并结合机器学习算法，构建预测模型，可以实现逆向解析适配体与靶标结合的结构密码与亲和力规律。

（3）联合方法学创新：SELEX测序可以联合单分子技术、空间组学或宏基因组学方法，达到在复杂样本中直接筛选功能性核酸元件的目的，为开发具有卓越体内性能的适配体药物奠定坚实基础。

 

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参考文献

[1] Li Y, Tam WW, Yu Y, et al. The application of Aptamer in biomarker discovery. Biomark Res. 2023;11(1):70.

[2]Guo L, Song Y, Yuan Y, et al. Identification of nucleic acid aptamers against lactate dehydrogenase via SELEX and high-throughput sequencing. Anal Bioanal Chem. 2021;413(17):4427-4439.

[3] Qiu F, Xie D, Chen H, et al. Generation of cytotoxic aptamers specifically targeting fibroblast-like synoviocytes by CSCT-SELEX for treatment of rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2025;84(5):726-745.