腺病毒载体+单抗筛选：中国团队提出HRSV疫苗研发新策略，成功稳定关键免疫靶点构象

 

2023年6月，由段招军研究员团队联合完成的研究成果发表于《中国人兽共患病学报》。该研究成功构建出高效表达人呼吸道合胞病毒（HRSV）融合前F蛋白的重组人5型腺病毒，凭借AM14和D25单克隆抗体的精准筛选，攻克了HRSV疫苗研发中“稳定维持核心免疫靶点构象”的关键难题。

 

一、背景

人呼吸道合胞病毒（HRSV）是全球范围内威胁人群健康的重要病原体，尤其对5岁以下婴幼儿、老年人及免疫功能低下人群危害显著。数据显示，2019 年全球约3300万5岁以下儿童感染HRSV，超13万儿童因此死亡。

目前，临床治疗依赖的帕丽珠单抗价格昂贵、半衰期短，仅适用于特殊人群，而且2023年一款HRSV疫苗Arexvy获批上市，但仅针对老年人群体。因此，研发安全、高效、覆盖更广泛人群的HRSV疫苗，成为WHO优先推荐的公共卫生任务，而融合前F蛋白（PreF）作为HRSV激发保护性免疫的核心靶点，成为疫苗研发的关键突破口。

 

二、人5型腺病毒载体优势

重组腺病毒载体是当前疫苗研发领域的成熟技术路径，其中人5型腺病毒（Ad5）载体具备多重优势：

（1）感染宿主广泛，尤其具有呼吸道黏膜嗜性，完美匹配 HRSV 呼吸道感染的致病特点，适合开发黏膜疫苗；

（2）载体容量大、基因转导效率高，能高效介导外源基因（如HRSV PreF 蛋白基因）表达；

（3）所表达的蛋白接近天然构象，能精准激发机体免疫应答；

（4）易于构建和体外扩增，可获得高滴度重组病毒，且安全性已在流感、新冠等疫苗的临床研究中得到验证。

将Ad5载体与HRSV PreF蛋白结合，研发重组腺病毒载体疫苗，成为解决 HRSV 防控难题的重要方向，而筛选能稳定维持PreF构象的蛋白突变体，是该疫苗研发的核心步骤。

 

三、AM14/D25 单克隆抗体贯穿研发关键环节

本研究的核心目标是筛选出能稳定维持 HRSV A 亚型PreF构象的F蛋白突变体，将其插入非复制型人5型腺病毒载体中构建重组腺病毒，为后续疫苗评价提供基础。核心方法是形成“突变体构建-构象筛选-载体构建-验证”的闭环：

（1）首先，构建 5 种 F 蛋白突变体真核表达质粒（SCG3M、SCG5M、PreF、PrefusogenicF、PostF），并优化密码子、替换信号肽以提升表达效率；

（2）其次，转染 HEK293 细胞后，采用夹心法 ELISA，以 AM14 和 D25 为检测抗体，筛选能稳定结合两种抗体的突变体—仅能同时识别SiteV和SiteØ 表位的突变体，才是真正稳定的PreF构象；

（3）然后，将筛选出的SCG3M和SCG5M突变体基因，通过同源重组插入 Ad5 载体，构建重组腺病毒（pAd5-SCG3M、pAd5-SCG5M）；

（4）最后，对重组腺病毒进行包装、扩增、纯化，通过Western blot、Native-PAGE 等验证F蛋白表达量、构象及三聚体结构。

 

注：A为５种不同F蛋白突变体结构图：B为单克隆抗体D25检测F蛋白突变体构象；C为单克隆抗体AM14检测 F蛋白突变体构象

图1 ５种不同的F蛋白突变体及单克隆抗体D25和AM14对F蛋白突变体构象鉴定

 

ELISA 结果显示，5 种突变体中仅SCG3M和SCG5M能与AM14（SiteV 表位）和D25（SiteØ 表位）同时稳定结合（复孔验证结果一致）；PreF和 PrefusogenicF仅能结合D25（SiteØ），无法结合AM14（SiteV）；PostF（融合后构象）与两种抗体均仅为微弱结合，证明SCG3M和SCG5M 是稳定维持 PreF 构象的候选序列。

 

图2 pAd5-SC-3M和pAd5-SC-5M的PCR鉴定

 

将 SCG3M和SCG5M基因插入Ad5载体后，通过PCR扩增鉴定，在 pAd5-SCG3M和pAd5-SCG5M中均扩增出1820bp的目的条带，与预期大小一致，测序结果进一步证实外源基因插入正确，重组腺病毒质粒构建成功。

 

注：A为单克隆抗体D25检测重组腺病毒 F蛋白融合前构象；B为单克隆抗体AM14检测重组腺病毒 F蛋白融合前构象

图３　两种重组腺病毒转染HEK293细胞后表达F蛋白前构象鉴定

 

重组腺病毒转染HEK293细胞后，收集上清液进行ELISA检测，结果显示 pAd5-SCG3M和pAd5-SCG5M仍能与AM14和D25特异性结合，空载体pAd5-vector与两种抗体均无结合反应，证明重组腺病毒表达的F蛋白持续维持 PreF 构象，未发生构象漂移。

 

注：A为10倍镜HEK293细胞完全病变（CPE显微镜图）；B、C和 D分别为pAd5-SC-3M、pAd5-SC-3M和pAd5-vector三组样本纯化后电镜图（100nm）

图４ HEK293细胞病变和氯化铯梯度纯化后重组腺病毒的电镜图

 

经氯化铯密度梯度离心纯化后，电镜观察显示 pAd5-SCG3M、pAd5-SCG5M 和空载体均为结构完整、大小均一的腺病毒颗粒；有限稀释法测定滴度，pAd5-SCG3M为2.016×10¹⁰ IU/mL，pAd5-SCG5M为2.52×10¹⁰ IU/mL，空载体为2.948×10¹¹IU/mL，高滴度满足后续动物实验需求。

 

注：A：１为pAd5-SC-3M（10^７个/孔）；２为pAd5-SC-3M（10⁸个/孔）;３为pAd5-SC-3M（10⁹个/孔）;４,８为pAd5-vector（10⁹个/孔）;５为pAd5-SC-5M（10⁷个/孔）;６为pAd5-SC-5M（10⁸个/孔）;７为pAd5-SC-5M（10⁹个/孔）。B:１为 pAd5-SC-5M（10⁹个/孔）;２为 pAd5-SC-5M（10⁹个/孔）;３为pAd5-vector（10⁹个/孔）病毒感染滴度完全病变后各取20μL加入蛋白胶电泳

图5　SDS-PAGE分析重组腺病毒（pAd5-SC-3M 和pAd5-SC-5M）感染细胞后外源基因F蛋白表达情况和NativeＧPAGE分析F蛋白三聚体

 

SDS-PAGE检测显示，pAd5-SCG3M和pAd5-SCG5M均能高效表达约 68kDa 的F蛋白单体，且pAd5-SCG5M的表达量显著高于pAd5-SCG3M；Native-PAGE 检测显示，两种重组腺病毒表达的F蛋白均以三聚体形式存在（相对分子质量约为单体的3倍），与天然HRSV F蛋白结构一致，为激发免疫应答提供了结构基础。

综上，本研究首次通过 AM14和D25单克隆抗体的精准筛选，获得了两种高效表达 PreF 构象的重组Ad5载体，解决了HRSV疫苗研发中“如何稳定表达免疫原性核心靶点”的关键问题。单克隆抗体AM14和D25均购自天津卡梅德生物物科技有限公司（简称“卡梅德生物”）。

 

卡梅德生物多年来致力于蛋白与抗体表达领域的研究，不仅拥有覆盖鼠、兔、豚鼠及羊驼等多物种的高质量单克隆抗体产品，而且提供多物种单克隆与多克隆抗体制备服务。依托五大核心技术平台，我们提供从抗原设计到抗体应用鉴定的一站式、可定制的技术服务，交付具有pM级高亲和力与高特异性的抗体产品，助力您的科研成果转化。

 

参考文献

[1]马亚林,柴鹏弟,王金冬,等.表达呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的重组人5型腺病毒的构建[J].中国人兽共患病学报,2023,39(06):515-522.

[2]李红欢,王泽轩,乔彦杰,等.表达PRRSV NADC30-like GP3重组腺病毒的构建及小鼠免疫效果评价[J].中国兽医学报,2025,45(11):2309-2317.[3]马培凯.PD-L1抑制剂协同治疗性HPV16重组腺病毒疫苗的靶向抗肿瘤作用研究[D].浙江省医学科学院,2025.