单链抗体文库构建

抗体是由B淋巴细胞产生的，能够参与体液免疫的免疫球蛋白，它由可变结构域、轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）组成，抗体通过其可变片段去识别靶抗原。1980年代，BIrd等人设计了单链抗体（scFv）作为VL和VH的遗传融合体，它通过短柔性肽去链接VL和VH。scFv是具有抗体活性的最小结合单元，由于其缺少Fc结构域，因此它的体积很小，约为25 kDa，与全长抗体相比，它更容易穿透组织屏障，也更容易渗透在肿瘤组织中，能够应用于靶向癌症治疗药物方面，同时，在检测试剂中也发挥着重要作用。此外，基于scFv不含Fc片段的特点，其免疫原性较低，在人体内引起免疫反应的风险也比较小。scFv还可以在多种表达系统中进行高效表达，包括原核表达系统和真核表达系统，如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。

Fig. 1 传统抗体与单链抗体结构对比

单链抗体的应用：

scFv可以与化学毒素相连形成免疫毒素，进而靶向并杀死肿瘤细胞。此外，scFv还可以连接到T细胞上，构建成嵌合抗原受体T细胞（CAR-T），用于癌症的治疗。scFv可以中和病毒表面的特定抗原，从而抑制病毒的复制和传播。scFv可以与荧光蛋白等标记物融合，用于疾病的早期诊断和定位。噬菌体展示技术可以将scFv展示于噬菌体表面，通过构建单链抗体文库使药物筛选变得更加方便快捷。

scFv抗体库的制备：

首先，从免疫动物的外周血中分离出外周血单个核细胞（PBMC），提取PBMC中的总RNA，在提取过程中要注意RNA的完整性和纯度。将提取的RNA作为模板，逆转录成cDNA。之后再以cDNA为模板，通过PCR扩增出VH和VL的基因，一般会进行两轮PCR扩增以提高抗体的特异性和产量。使用特定的Linker序列将VH和VL基因连接起来，形成完整的scFv基因，将scFv基因插入到噬菌粒载体中，构建表达载体，载体中可以包含启动子、终止子、复制原点等，来确保scFv基因在宿主细胞中的正确表达。将构建好的表达载体转化到宿主细胞中，如大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞等。表达的scFv抗体基于噬菌体抗体文库构建技术，进行单链抗体文库构建。可以使用固相化的抗原与抗体库孵育，经过几轮的洗涤、洗脱、扩增过程，筛选出具有特异性和亲和力的单链抗体。从筛选出的单链抗体库中挑选阳性克隆，并进行测序，验证测序结果是否与预期的scFv基因序列一致。

可制备scFv抗体的动物：

不同种属的动物在免疫系统以及抗体特性方面存在差异，这些差异会对单链抗体生产的效率、特异性造成影响。常用的单链抗体生产的动物是兔、羊、大鼠。其中，兔的IgG在免疫应答中有较高的敏感性和特异性，且兔IgG的结构相对简单，稳定性较高，因此兔是制备高亲和力、高特异性的单链抗体的理想选择，兔单链抗体在需要高灵敏度和高特异性的疾病诊断和治疗中被广泛应用。大鼠是常用的实验动物之一，它的IgG具有多种亚型，不同亚型在结构和功能上也存在一定差异，大鼠的免疫系统能够产生多样化的抗体，因此大鼠被广泛用于具有特定功能和特性的单链抗体生产，在模拟人类疾病状态的实验研究中，大鼠单链抗体是最为常见的。羊IgG也具有多种亚型，且羊的免疫系统能够针对多种抗原，羊单链抗体在畜牧疾病防控中具有潜在的应用价值。

表1. 可制备单链抗体的动物的比较

动物种属	优点	缺点	应用领域
兔	敏感性、高特异性、结构稳定	制备成本相对较高	疾病诊断、治疗、研究
羊	免疫系统多样、能够产生多种抗体	研究和应用相对较少	畜牧业疾病防控
大鼠	免疫系统多样化、抗体亚型丰富	可能存在种属特异性问题	药物开发、疾病诊断

卡梅德生物拥有成熟的单链抗体文库构建体系，可制备关于免疫动物的脾细胞、人源B淋巴细胞的scFv抗体库。并且我们会对scFv抗体序列信息进行全方面分析并用多种实验验证，如EC50测定，亲和力分析，流式阻断验证等。我们拥有包括M13、T4、T7和λ噬菌体在内的多种噬菌体抗体文库构建平台，可满足客户的不同需要，提供个性化的单链抗体文库构建服务。卡梅德生物擅长构建不同类型的scFv噬菌体展示文库，如免疫库、天然库、半合成库、合成库等。我们构建的scFv抗体库库容量庞大，可产生高亲和力的scFv抗体。我们可为客户提供包括pMECS、pComb3X和pCANTAB 5E等多种噬菌粒载体。我们有TG1大肠杆菌、 XL1-Blue和ER2738等菌种，经扩大培养后，可用于噬菌体侵染。我们构建的抗体库库容量庞大，可达10⁹，具有较高的目的片段插入率高，有利于筛选出令客户满意的scFv抗体。我们还可根据客户需要，对筛选的scFv进行表达与纯化。除原核表达系统外，我们还有各种的抗体蛋白的真核表达系统，如哺乳动物细胞、酵日细胞、植物和昆虫细胞表达系统等，可为客户生产制备高质量scFv抗体。