噬菌体展示文库构建与筛选-卡梅德生物

   噬菌体展示技术（phage display）是一种用于识别蛋白质和其他大分子配体的体外筛选技术。原理是将外源肽段或蛋白质和噬菌体外壳蛋白结构融合表达，且不影响外壳蛋白正常功能表达，使得外源基因随子代噬菌体重新组装呈现在噬菌体表面。

噬菌体抗体库构建：
   通过将蛋白、抗体或多肽与噬菌体pIII蛋白融合表达，使之参与噬菌体组装，并展示在噬菌体表面。所有展示不同外源基因的噬菌体的集合，称为噬菌体展示文库。然后再对噬菌体文库进行筛选。
为了构建库容足够大且多样性的文库，首先需要得到不同序列的核酸片段。包括人工合成法、cDNA法、DNase I随机水解DNA等方法。目前利用cDNA法得到目的基因并进行噬菌体抗体库构建的操作流程包括：总RNA提取；反转录获取cDNA；设计引物，以cDNA为模板，PCR得到基因序列且扩增；将目的基因片段克隆至噬菌粒载体中（载体与 PCR 产物酶切连接）；电转感受态宿主细胞（细菌文库构建），同时辅助噬菌体超染；收集上清，上清即为噬菌体展示文库。

噬菌体展示库抗体筛选：
    通过将抗原包被至固相载体，使用构建的噬菌体展示文库对特异性结合的噬菌体进行多轮淘洗筛选，当淘洗后的噬菌体达到合适富集程度后进行ELISA验证以排除非特异性序列，最后对ELISA验证阳性克隆进行测序获得相应纳米抗体的序列。
    噬菌体展示库抗体筛选包括两个主要步骤: 淘筛和鉴定。噬菌体展示库抗体筛选的方法包括生物淘洗法、竞争法、消减法、选择性感染筛选、延迟性感染筛选等方法，而生物淘洗法运用最多。
    生物淘洗法:以靶蛋白为固定相，以噬菌体纳米抗体展示库为流动相，经过一段时间的共同孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3~5轮的吸附-洗脱-扩增”后，即可得到与靶蛋白具有高亲和性的抗体。（1）固相淘筛法：将抗原按照浓度梯度降低顺序包被在固相支持物上。文库与固相支持物共孵育，洗去未结合的噬菌体，即可达到筛选的目的。（2）液相淘筛法：将抗原标记生物素后包被在链霉亲和素磁珠，在液相中借助磁场作用，洗去（PBS/PBST）未结合的噬菌体，保留已经结合的噬菌体。改变洗脱条件（酸/碱/竞争分子）洗脱结合的噬菌体，用洗脱液中的噬菌体感染细菌，扩增后进行下一轮的筛选，通过反复几次即可富集到目标蛋白。（3）细胞淘筛法：应用单层生长、粘附或者悬浮的完整细胞对噬菌体库进行直接淘选，可筛选到细胞表面特标志物的特异性抗体。