GST-Pull down实验原理及FAQ

一、GST-Pull down实验原理是什么？

Pull down技术的基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），但细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。
被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。通过pull down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
GST-pull down的主要原理是利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合，而融合蛋白通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）亲和结合。我们把GSH与琼脂糖交联形成GSH琼脂糖珠，就能够将带有GST标签的诱饵蛋白固定，当体系中存在与诱饵蛋白有直接相互作用的靶标蛋白时，它就能够与微珠固相复合物结合而被“拉”下来。
 

• GST-Pull down实验有哪些常见问题呢？如何解决？

 

1. GST-Pull down实验结果出现假阳性是为什么，怎么解决？

答：两种并不互作的DNA结合蛋白可能会因为DNA的存在而出现相互作用的假阳性结果，因此，在进行GST pull-down实验时，加入核酸酶的步骤十分必要。
 

1. 影响GST-Pull down实验结果的因素有哪些，该如何解决？

答：（1）我们都知道，实验第一步是融合表达GST标签的融合蛋白，那么表达载体的选择便是一个重要因素。所以，在进行载体选择时，要考虑到载体表达蛋白量的高低、是否能被诱导剂诱导表达等因素，在这里常用的载体是pGEX-4T-1。

1. 在进行蛋白的诱导表达时，可溶性表达温度也是至关重要的一个因素。当温度过高，载体就容易形成包涵体，若复性不顺利，蛋白没有活性，会影响后续的实验。所以，建议进行一个诱导温度的摸索，常见的诱导温度在16℃~25℃。
2. 诱导时间也非常重要，细菌在对数生长期时，是最佳的添加诱导剂诱导表达的时间。诱导时间过长的话，诱导剂不会被细菌代谢，会一直进行蛋白的诱导表达过程。诱导剂的浓度、诱导的时间、培养的温度，这些因素都是综合影响着蛋白的表达结果。

 

1. 同一批次提取的蛋白，胶跑出的条带都不一致，这是什么原因呢？

答：可能涉及几个原因：（1）拔梳子时胶错动，加入样本后渗入其他孔或漏出。因为内参表达高，可能不会显示出差异。（2）加入样本时不均匀也可能会产生误差。（3）制胶应保证均匀无气泡，玻璃板干净，这样才能保证结果一致可靠。
 

1. 样品中的蛋白被蛋白酶降解怎么办？

答：样品中的蛋白被蛋白酶降解，这种时候建议操作过程中添加蛋白酶抑制剂，有条件的话，全程在4℃环境下操作，可缓解样品中蛋白降解的情况。
 

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