合作成果|H7亚型禽流感病毒荧光微球抗体检测方法的建立与评价！！！

以H7N9为代表的高致病性禽流感病毒在畜禽养殖领域广泛传播，不仅对养禽产业构成重大隐患，还存在跨物种传播导致人畜共患病的风险。实验室常规应用的血凝抑制试验（HI）检测结果准确，但操作流程繁琐、耗时较长；适用于现场快速检测的胶体金试纸条则存在检测灵敏度与定量分析能力不足的缺陷。

2024年，朱向东团队在《中国动物检疫》期刊发表了题为《H7亚型禽流感病毒荧光微球抗体检测方法的建立》的研究论文。他们围绕高致病性H7亚型禽流感病毒（AIV）防控的实际应用需求，创新性地将荧光微球标记技术与免疫层析技术体系相结合，成功开发出一种具备快速检测能力、高灵敏性及精准定量功能的血清抗体新型检测技术。

该检测方法的核心技术创新在于采用荧光微球替代传统胶体金材质作为检测信号承载介质。荧光微球具有荧光信号强度高、稳定性强、易于仪器定量检测的显著特点。该技术方案使检测方法保留了免疫层析技术便捷快速的核心特质，同时也显著提升了整体的检测效能，契合当下现场诊断向精准高效方向发展的行业趋势。

 

一、核心实验体系构建与优化

 

研究团队制备了重组H7亚型AIV血凝素（HA）蛋白，以满足检测需求。SDS - PAGE电泳分析数据证实，所得蛋白纯度达标，分子量与预期一致，为后续检测方法的搭建奠定了关键基础。

 

图1 重组HA蛋白包涵体纯化结果

 

研究团队通过严谨的单变量分析对反应体系进行了系统优化，确保了方法的最佳性能：

(1) 膜包被浓度优化：通过矩阵实验筛选质控线（C线）与检测线（T线）的最佳包被浓度。如表1数据所示，当C线（羊抗鼠IgG）为1.5 mg/mL、T线（重组HA蛋白）为1.0 mg/mL时，阳性/阴性信号比值（P/N值）达到最高的33.90，获得了最佳信噪比。

(2) 标记与反应条件确定：确定了荧光微球偶联鼠抗鸡IgG的最佳标记浓度为0.005 mg/mL。同时标准化了操作流程：血清按1:10稀释，加样量100 μL，反应16分钟后进行检测。

 

二、系统性性能验证结果分析

 

1. 灵敏度对比显示显著优势

通过与国家标准HI方法进行头对头比较，新方法的灵敏度优势得到证实。如表1结果所示，对同一份阳性血清进行倍比稀释检测，HI法的检测下限为1:8稀释度，而新建荧光微球法在1:16稀释度时仍呈阳性。这表明新方法的检测灵敏度比传统HI“金标准”提高了2倍，更有利于早期感染识别或低水平抗体的监测。

 

表1 本研究建立的方法与血凝抑制试验灵敏度比较

 

2. 特异性验证结果可靠

如表2所示，该方法仅对H7亚型AIV阳性血清产生强阳性反应，而对H5、H9亚型AIV以及新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）等其他常见禽病病原的阳性血清均无交叉反应，证明了其优异的特异性，有效避免了假阳性干扰。

 

表2 H7亚型AIV荧光微球检测方法的特异性分析结果

 

3. 临界值确立与重复性良好

研究团队以64份阴性血清检测数据为基础，采用均值 + 3倍标准差的统计方法，确定阳性判断临界标准为T/C值≥13%。重复检测实验结果显示，批内测定变异系数（CV）处于3.13% - 8.46%区间内，验证该测定方法精密度达标，结果稳定可靠。

 

表3 阴性样本检测及分析结果

 

4. 与标准方法符合率高

采用所建方法与HI法对208份临床血清样本开展平行检测，如表4所示，结果显示两种检测方案总符合率为95.67%（199/208），阳性符合率达98.79%（163/165）。该检测数据证实所建方法与现行国家标准方法具备良好一致性，检测结果兼具准确性与可靠性。

 

表4 符合率试验结果

 

Ø 本研究建立的方法具有诸多优势：相较于分子诊断技术，它无需复该仪器更为简易，更适宜在基层推广。

相较于HI试验，它更为快速、灵敏，且具备定量的潜力；相较于传统胶体金试纸条，它在灵敏度和定量能力方面实现了重大提升。

本研究构建的H7亚型AIV荧光微球抗体检测技术，采用了卡梅德生物所提供的H7亚型AIV重组HA蛋白。该技术成功弥补了当前检测手段的缺陷，兼具快速操作的可行性、高度灵敏的特性、检测的准确性以及定量检测的效能，契合现场诊断的需求，为高致病性AIV的精准防控筑牢了技术基础。

卡梅德生物依托成熟的蛋白质表达与纯化平台，能够确保持续、稳定地为该检测技术或类似产品提供高性能的重组蛋白原料，从源头上保障终端检测产品具备卓越的性能。