利用免疫和合成VHH噬菌体展示文库加速VHH发现

一．VHH的发现

1993年，Hamers团队于《自然》杂志发表了具有划时代意义的论文 “Naturally occurring antibodies devoid of light chains”。他们证实，骆驼科动物体内存在一类独特抗体，这类抗体完全由两条重链构成，没有轻链，因而其抗原结合部位仅由一个单一的重链可变区（VH）组成。尽管结构简化，但VH仍能形成完整且具有高亲和力的抗原结合口袋。这颠覆了传统认知，即传统抗体必须由轻重链可变区共同构成结合位点。重链抗体进入人们视野后，科学家大胆猜测，单独的重链可变区（VHH）是否同样能够稳定地结合抗原？这一猜想随后得到了证实。几乎在骆驼VHH被深入研究的同时，科学家在鲨鱼等软骨鱼类的血液中也发现了功能类似的单域抗体，称为“VNAR”。这证明“单域抗体”策略在脊椎动物免疫系统中是至少独立进化两次的成功方案，也从反面印证了其生物学合理性与优势。

图1：VHH抗体的结构（文献[1]）

 

二．VHH噬菌体展示文库的创造

VHH具有体积小、稳定性高、易于克隆和表达等潜在优势。尽管VHH具备这些天然属性，但要成为广泛应用的工具，需要建立稳定的生产平台。于是，研究人员将VHH基因与噬菌体展示技术相结合。

1. PBMC的获得

由于B淋巴细胞或浆细胞难以单独分离，因此可根据需求，从未经免疫刺激或经抗原免疫的羊驼体内收集外周血，并分离其外周血单个核细胞（PBMC），从中获取抗体信息。

2. cDNA文库的制备

从分离出的PBMC中提取总RNA，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。抗体的cDNA文库制备完成后，可置于 -80℃冰箱妥善保存，用于后续噬菌体文库的构建。

3. VHH序列的获得

VHH序列较短，单次PCR难以直接准确扩增，需采用巢式PCR的方法进行精准扩增。巢式PCR有2对扩增引物，第一对引物扩增出较长片段，扩增区域大致有2种，分别为VHH - CH1 - 铰链 - CH2区及VHH - 铰链 - CH2区，其作用如同“放大镜”，对有效序列区域进行定位和放大；第二对引物设计在第一次PCR产物序列内，能够更精准地扩增VHH序列。

4. VHH噬菌体展示文库的制备

第二次PCR时设计的巢式引物会引入载体上的酶切位点，因此PCR终产物需经酶切后与噬菌体载体连接。卡梅德生物采用pMECS载体进行文库制备，质粒文库构建完成后，将其转化到大肠杆菌中，在辅助质粒的作用下进行噬菌体包装。包装及扩增后的噬菌体表面携带有VHH抗体及便于检测的标签抗体，经库容鉴定、插入率鉴定及多样性鉴定合格后，标志着VHH文库构建完成，VHH噬菌体展示技术成功应用，为下游的抗体生产奠定基础。

图2：VHH噬菌体文库构建过程（文献[3]）

 

三．VHH抗体生产

VHH文库构建完成后，以抗原为“诱饵”，从这个庞大的库中“钓出”那些表面展示着能结合该抗原的抗体片段的噬菌体。整个过程大致为“吸附 - 洗涤 - 洗脱 - 扩增”的循环过程又称为“淘选”过程。随着淘选次数增加，特异性高、亲和力强的噬菌体被富集并获得。我们通过ELISA的方式对筛选到的噬菌体进行初步验证，进一步证实其与靶标的结合能力。对高亲和力的噬菌体基因组进行测序分析，从测序出的序列中定点提取被展示的VHH序列，通过原核表达系统、真核表达系统或哺乳动物细胞表达系统等方式进行表达VHH抗体生产，通常我们会选用哺乳动物细胞表达系统进行抗体生产，以最大程度保留VHH的空间结构，且其后续亲和力的验证效果也相对较好。

图3：VHH噬菌体文库筛选过程（文献[4]）

 

卡梅德生物专注于抗体药物发现及相关CRO服务，在噬菌体展示抗体开发领域，已建立了从抗体文库构建、筛选到工程化改造的完整技术体系，可为客户提供较为完善的定制服务。

 

引用：

[1] Chen F, Liu Z, Jiang F. Prospects of Neutralizing Nanobodies Against SARS-CoV-2. Front Immunol. 2021 May 28;12:690742. doi: 10.3389/fimmu.2021.690742. PMID: 34122456; PMCID: PMC8194341.

[2] Narutoshi Tsukahara, Akikazu Murakami, Maiko Motohashi, Hiroshi Nakayama, Yoshiro Kondo, Yuji Ito, Takachika Azuma, Hidehiro Kishimoto, An alpaca single-domain antibody (VHH) phage display library constructed by CDR shuffling provided high-affinity VHHs against desired protein antigens, International Immunology, Volume 34, Issue 8, August 2022, Pages 421–434,

[3] Wang W-C, Chang J, Lee C-H, Chiang Y-W, Leu S-J, Mao Y-C, Chiang J-R, Yang C-K, Wu C-J, Yang Y-Y. Phage display-derived alpaca nanobodies as potential therapeutics for Naja atra snake envenomation. Appl Environ Microbiol. 2024 Aug 21;90(8):e0012124. doi: 10.1128/aem.00121-24. Epub 2024 Jul 9. PMID: 38980046; PMCID: PMC11337809.

[4] Sawada T, Oyama R, Tanaka M, Serizawa T. Discovery of Surfactant-Like Peptides from a Phage-Displayed Peptide Library. Viruses. 2020 Dec 15;12(12):1442.