ELISA检测常见问题及解决方案

一、ELISA技术概述

ELISA（酶联免疫吸附试验）是基于抗原与抗体特异性结合原理开发的免疫检测技术，凭借高灵敏度、特异性强、操作简便等优势，已成为生命科学研究、临床诊断及工业质量控制中应用最广泛的检测方法之一。

ELISA的核心原理是通过酶标记抗体或抗原，利用酶催化底物产生可检测的显色反应，将免疫反应的特异性与酶促反应的放大效应相结合，实现对目标物质的定性或定量分析。

ELISA的操作流程包括包被、封闭、加样、孵育、洗涤、显色、终止及读数，每个步骤的规范性直接影响检测结果的准确性，而科学的ELISA实验方案是保障检测成功的基础。

 

二、ELISA的主要应用领域

在临床诊断领域，ELISA检测已成为传染病筛查、自身免疫病诊断、肿瘤标志物检测的核心手段。通过ELISA检测血清中的乙肝表面抗原、丙肝抗体等指标，可快速实现传染病的早期筛查与确诊。

科研领域中，ELISA常用于蛋白表达定量、抗原抗体相互作用分析、药物筛选等研究，科研人员通过优化ELISA实验方案，可显著提高检测的灵敏度和重复性，为实验数据的可靠性提供保障。

此外，在食品与农业领域、环境监测、生物制品质量控制等领域，ELISA也凭借其快速、低成本的优势发挥着重要作用。

图1 ELISA原理示意图

 

三、ELISA检测常见问题及解决方案

ELISA检测的结果准确性依赖于实验方案的严格执行和操作细节的精准把控，实际操作中常出现各类问题。

1. 阴性对照OD值偏高（假阳性）

阴性对照OD值超出正常范围会直接导致检测特异性下降。主要原因包括包被抗原过量导致非特异性结合、封闭不充分使酶标板未结合位点暴露、洗涤步骤不彻底残留酶标记物。

解决方案：

• 严格按照ELISA实验方案调整包被浓度，通常抗原包被浓度控制在1-10μg/mL，通过预实验确定最佳浓度；
• 延长封闭时间至1.5-2小时（37℃），或采用5%脱脂奶粉与1% BSA 混合封闭液，增强封闭效果；
• 洗涤时采用PBST洗涤液，每步洗涤3-5次，每次浸泡30秒，确保孔内残留液完全去除；
• 实验结束后及时清洗酶标板，避免残留试剂干涸附着。

2. 标准曲线线性不佳

标准曲线线性关系差会导致定量结果不准确，常见原因包括加样误差、标准品稀释过程中未充分混匀、孵育温度波动过大、酶标仪读数误差。

解决方案：

• 使用校准合格的精密移液器，加样时保持枪头垂直，避免气泡产生，加样后轻轻震荡酶标板混匀
• 标准品稀释按梯度逐步进行，每步稀释后充分颠倒混匀，避免浓度梯度偏差；
• 严格控制孵育温度在37℃±0.5℃，孵育箱内放置温度计实时监测，避免开门频繁导致温度波动
• ELISA检测前对酶标仪进行校准，选择合适的波长，确保读数准确性。

3. 检测重复性差

同一批次或不同批次实验中，平行样本OD值变异系数过大，主要原因包括酶标板孔间差异、试剂使用前未充分混匀、显色时间控制不一致、样本处理不均。

解决方案：

• 选择批内差异小的优质酶标板，使用前检查板孔是否有划痕或污染；
• 所有试剂（酶标记物、底物、终止液）使用前置于室温平衡30分钟，充分颠倒混匀，避免局部浓度不均；
• 严格按照ELISA实验方案规定的显色时间操作，设置定时器，确保所有孔同时显色、同时终止；
• 样本处理时充分震荡混匀，避免离心后上清液中目标物质分布不均，血清样本避免溶血或反复冻融。

4. 灵敏度不足

阳性样本OD值偏低，无法有效区分弱阳性样本与阴性样本，主要原因包括抗体工作浓度过低、孵育时间不足、底物活性下降、洗涤过度导致抗原抗体复合物脱落。

解决方案：

• 通过棋盘滴定法优化抗体工作浓度，确定酶标记抗体的最佳稀释比例；
• 延长孵育时间，可采用4℃过夜孵育（12-16小时），增强抗原抗体结合效率；
• 检查底物有效期，确保在保质期内使用，底物储存需严格避光冷藏（2-8℃），避免活性丧失；
• 调整洗涤强度，减少洗涤次数或缩短浸泡时间，避免过度洗涤破坏免疫复合物。

 

四、优化ELISA实验方案的关键要点

ELISA检测的稳定性和准确性核心在于建立并严格执行科学规范的实验方案。

1. 应选用高特异性、亲和力的配套试剂，从源头上保证质量。

2. 操作必须标准化，从样本处理到孵育洗涤，每个步骤都需严格遵循规程，以最小化人为误差。

3. 完善的质量体系不可或缺，通过设置有效的对照监控实验全程。

4. 可靠的仪器性能与稳定的实验环境也是确保结果准确的重要保障。

通过以上综合措施，可显著提升ELISA检测的灵敏度和重复性，为其广泛应用提供坚实基础。

 

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