Bacmid的构建实验流程

一、Bacmid是什么
昆虫表达系统是通过将转移载体中的表达组件转座到大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体上，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清侵染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白的方法，Bacmid即为杆状病毒穿梭载体。

二、重组Bacmid的构建
1. 目的基因的克隆
首先我们通过PCR扩增获得目的基因。
2. pFastBac重组质粒的构建
将目的基因构建到转移载体pFastBac上。
3. DH10Bac菌株的转化
DH10Bac菌株是pFastBac载体的宿主细胞，pFastBac载体具有Tn7转座元件，可以将目的基因通过转座的方式整合到大肠杆菌的Bacmid质粒上的特定位点，目的基因的插入会导致bacmid上的LacZ基因产生移码，进而通过蓝白斑筛选鉴定出阳性重组bacmid，提取后转染昆虫细胞。
4. 阳性克隆的鉴定
挑取白色单克隆菌落接种分别接种于5ml含有50 mg/ml卡那霉素，7 mg/ml 庆大霉素，10 mg/ml 四环素，摇菌，菌液PCR初步筛选阳性克隆菌。
5. 重组质粒的提取
小量抽取质粒，PCR验证杆粒正确性。PCR验证正确的重组质粒可以用于后续的昆虫细胞转染，以获得P1代和P2代病毒以及最终的目的蛋白。

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