永生化细胞系构建

1.什么是细胞永生化
细胞永生化是指细胞在体外培养的过程中，由于自身基因变化或者是外界各种刺激条件，避免的正常传代细胞衰老死亡的过程，以至于可以长期传代培养、无限分裂增殖。
2.细胞永生化的意义

1. 能获得大量的细胞资源，改善细胞传代少、增殖慢的困境，使细胞可以无限传代，并且永生化的细胞生长更强劲，节省了实验周期；
2. 可以帮助研究者熟悉掌握细胞增殖与衰老死亡的的生理过程；
3. 是体外研究肿瘤细胞各个阶段的的良好模型，为癌症治疗、抑制癌症细胞增殖等提供新的研究方向；
4. 在遗传上属于同一种群，能够建立相同遗传性状的细胞库，有助于实验结果的稳定性。

3.细胞永生化的方法

细胞永生化一般有两种分子机制：外源病毒蛋白抑制或者自身突变导致原癌基因活化或抑癌基因失活，使细胞绕过正常细胞的周期检查点，细胞衰老死亡途径受阻，达到无限增殖的目的;另一种是激活端粒酶使端粒长度延长，可以持续增殖；具有致瘤性的病毒如SV40病毒、EB病毒、人乳头状瘤病毒HPV等。
细胞永生化有不同的方法，不同的方法适用于不同的组织细胞。如HPV可介导人的上皮细胞如口腔上皮细胞、表皮细胞、角化上皮等的上皮细胞永生化；猿猴病毒的SV40 大T抗原（TAg）用于黏附细胞、成纤维细胞、内皮细胞等、EBV用于淋巴母细胞样细胞；端粒酶TERT则用于间充质干细胞和其他一些细胞。
3.1端粒酶TERT
端粒（Telomere）是一种真核细胞染色体末端DNA-蛋白复合体的特殊结构。端粒有重要的生物学功能，可保护染色体末端的正常结构，免于退化和消亡，因此在染色体正常复制、细胞凋亡和细胞转化等方面发挥重大作用。端粒酶可以合成新的端粒，从而延长端粒的长度，通常情况下，端粒酶表达量较低，但在病毒介导hTERT下，端粒酶可以正常表达，从而增长细胞的生命周期。
3.2 SV40的T抗原
SV40是真核细胞病毒，SV40的T抗原（TAg）通过与肿瘤细胞内抑制因子Rb和p53结合并抑制其功能而起作用。
3.3原癌基因
研究表明，原癌基因可以激活端粒酶的活性，因此激活Myc, c-Jun, c-Ias, vsrc、Mdm2、RAS、c-fos、Bmi1、CDK4等原癌基因可以促进细胞永生化的进程。
3.4抑癌基因
使抑癌基因p53, pRb, BRCA1, DPC4等失活，同样可以激活端粒酶，使细胞得到永生化。

4.细胞永生化的应用
永生化细胞系被广泛用作功能和分子研究的生物材料来源，并代表了基因组 DNA、表达 RNA 以及蛋白质和系统生物学分析的潜在无限来源。此外，这些细胞系可用作各种研究的培养模型，包括功能和血清学研究、分子和遗传研究、大规模药物库筛选、疫苗研究和高通量生物学研究。

5.卡梅德生物可以提供优质的细胞永生化服务
卡梅德生物在永生化细胞系方面有着丰富的经验，已成功将不同物种（如人、大鼠、小鼠以及猪）的不同细胞类型，如内皮细胞，上皮细胞，成纤维细胞，神经元细胞，以及难度较大的悬浮细胞，B细胞、T细胞，巨噬细胞等成功永生化。卡梅德生物提供的B细胞、T细胞和巨噬细胞永生化服务，目前B细胞永生化的方法主要有与肿瘤细胞融合制备杂交瘤细胞技术、EBV感染，如图2所示：

T细胞和巨噬细胞永生化的方法主要有SV40感染、EBV感染如图3所示：

6.卡梅德生物为客户提供细胞永生化的全流程介绍
以B细胞永生化为例，详细介绍EBV方法永生化的过程，主要分为B细胞扩增培养，制备EBV，B细胞的制备及EBV感染三大步骤。
6.1 扩增培养B细胞：将 B细胞密度调整到 (5-10) X 10⁶/L, 37℃、5% CO₂培养箱中培养 5-7天，培养期间不更换和补充培养基，以使细胞上清中富含 EBV。

6.2制备EBV：收集B细胞上清，离心，除去细胞碎片，收集上清，按超滤离心管说明要求，将上清超滤，收集滤液，按照超滤的先后顺序，将获得 EBV 病毒浓缩液分成 4 份，编号依次为： 1, 2, 3, 4。
6.3 B细胞的制备及EBV感染：将客户提供的人B细胞按每 5M/ml 铺扳，分别加入 5 或 10 μl 体积获得的 EBV 病毒37℃、5%CO₂培养箱中培养。
6.4 EBV感染4周后，如下图：

无论何时，细胞永生化在研究生物生长发育机制，调控生命活动，疾病诊断治疗等领域都有很大的研究意义。客户仅需要提供已经分离的PBMC细胞，至少4管，每管细胞数量>10⁶，剩下的交给卡梅德生物来完成，我们拥有您所需功能的任何物种和任何组织的永生细胞系，可以在短周期内完成永生化细胞系的构建， 并通过QC确认细胞可以繁殖12-15代，交付您满意的产品。