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卡梅德生物科技（天津）有限公司
入驻年限：6 年
- 联系人：
卡梅德-小智
- 所在地区：
天津 武清区
- 业务范围：
抗体、技术服务、体外诊断、原辅料包材、细胞库 / 细胞培养、ELISA 试剂盒
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哺乳动物细胞蛋白表达 FAQ
541 人阅读发布时间：2023-04-03 10:02
页面所属目录：技术支持
页面标题：哺乳动物细胞蛋白表达 FAQ
页面英文：burudongwuxibaodanbaibiaodaFAQ
页面关键词：哺乳蛋白表达、重组蛋白表达、哺乳动物细胞蛋白表达 FAQ
Q1：客户提供质粒的话，需要同时提供质粒的哪些信息？
A:客户需要提供以下信息：质粒的载体，目的序列，插入位点。最好可以提供包含目的基因的全载体序列。如果您对质粒的信息非常清楚，可以不做检测。如果不是很清楚，则建议先安排测序。
Q2：在哺乳动物系统中，常用的标签有哪些？
A:常用标签有 Fc、His 和 Flag 标签。添加Fc标签可以提高表达水平。His 和 Flag 标签是小标签，可以用于亲和纯化。
Q3：CHO 细胞与 HEK293 细胞有什么区别
A：CHO 细胞是中国仓鼠卵巢细胞，是目前表达外源蛋白最多最成功的细胞之一，CHO 细胞是使用最广泛的宿主细胞，它可以用来生产重组蛋白和重组单克隆抗体。这种细胞有明确的基因组信息，在应对人类致病病毒时展现出合理的安全性。此外，CHO 细胞表达系统最重要的优势之一是容易获得转基因细胞。然而，由于糖基化模式与人类不尽相同，导致CHO 细胞生产的重组蛋白在某种程度上仍然表现出免疫原性。
HEK293 细胞，又叫人胚胎肾细胞 293，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系。是哺乳蛋白表达常用的细胞之一，它的优势有：生长速度快、生长密度高、转染效率高、表达修饰后与人类蛋白的结构更相似。HEK293细胞由于其优秀的转染效率，主要用于瞬时表达。它的缺陷是在生长过程中，粘附强度相对较小，在实验过程中容易流失，从而影响实验结果。
Q4：瞬时转染与稳定转染有什么区别
A：用于瞬时转染的质粒与用于稳定转染的质粒不同。瞬时转染的质粒不需要有抗性，而用于稳定转染的质粒必须有抗性，以方便后续的克隆筛选。此外，所用的培养基和实验试剂也不同。瞬时转染的操作比构建稳定细胞系的操作要简单。构建质粒后，通过细胞复苏、转染、细胞培养和蛋白纯化就可以获得目标蛋白。要构建稳定的细胞系，应先将构建的质粒线性化，然后导入到培养的哺乳动物细胞中，并通过一定的转染方法使质粒和细胞融合。然后，可以通过细胞池筛选、单克隆筛选、细胞传代培养等步骤来获得稳定的转染细胞系。稳定细胞系的培养可以长期稳定地生产目标蛋白。
Q5：细胞转染方法有哪些，技术原理是什么
A：如下表所示
Q6：如果瞬时表达的表达水平较低，通常如何调整实验方案来达到提高表达水平的目的？
A：一般来说，蛋白质的表达主要由蛋白自身特性决定。常用的优化方式有密码子的优化，改变信号肽，改变表达载体，克隆策略（如 Fc 标记），检测细胞裂解液以确定蛋白质是否分泌和表达，改变宿主细胞系,转染模式的优化，细胞培养方案优化，纯化步骤中的缓冲液筛选（沉淀，溶解度），添加蛋白酶抑制剂（如果存在蛋白降解现象）。
页面标题：哺乳动物细胞蛋白表达 FAQ
页面英文：burudongwuxibaodanbaibiaodaFAQ
页面关键词：哺乳蛋白表达、重组蛋白表达、哺乳动物细胞蛋白表达 FAQ
Q1：客户提供质粒的话，需要同时提供质粒的哪些信息？
A:客户需要提供以下信息：质粒的载体，目的序列，插入位点。最好可以提供包含目的基因的全载体序列。如果您对质粒的信息非常清楚，可以不做检测。如果不是很清楚，则建议先安排测序。
Q2：在哺乳动物系统中，常用的标签有哪些？
A:常用标签有 Fc、His 和 Flag 标签。添加Fc标签可以提高表达水平。His 和 Flag 标签是小标签，可以用于亲和纯化。
Q3：CHO 细胞与 HEK293 细胞有什么区别
A：CHO 细胞是中国仓鼠卵巢细胞，是目前表达外源蛋白最多最成功的细胞之一，CHO 细胞是使用最广泛的宿主细胞，它可以用来生产重组蛋白和重组单克隆抗体。这种细胞有明确的基因组信息，在应对人类致病病毒时展现出合理的安全性。此外，CHO 细胞表达系统最重要的优势之一是容易获得转基因细胞。然而，由于糖基化模式与人类不尽相同，导致CHO 细胞生产的重组蛋白在某种程度上仍然表现出免疫原性。
HEK293 细胞，又叫人胚胎肾细胞 293，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系。是哺乳蛋白表达常用的细胞之一，它的优势有：生长速度快、生长密度高、转染效率高、表达修饰后与人类蛋白的结构更相似。HEK293细胞由于其优秀的转染效率，主要用于瞬时表达。它的缺陷是在生长过程中，粘附强度相对较小，在实验过程中容易流失，从而影响实验结果。
Q4：瞬时转染与稳定转染有什么区别
A：用于瞬时转染的质粒与用于稳定转染的质粒不同。瞬时转染的质粒不需要有抗性，而用于稳定转染的质粒必须有抗性，以方便后续的克隆筛选。此外，所用的培养基和实验试剂也不同。瞬时转染的操作比构建稳定细胞系的操作要简单。构建质粒后，通过细胞复苏、转染、细胞培养和蛋白纯化就可以获得目标蛋白。要构建稳定的细胞系，应先将构建的质粒线性化，然后导入到培养的哺乳动物细胞中，并通过一定的转染方法使质粒和细胞融合。然后，可以通过细胞池筛选、单克隆筛选、细胞传代培养等步骤来获得稳定的转染细胞系。稳定细胞系的培养可以长期稳定地生产目标蛋白。
| 瞬时转染 | 稳定细胞系构建 |
| 能够快速生产得到微量至中量的重组蛋白 | 能够长期稳定生产目的蛋白 |
| 实验成本低 | 得到稳转株之后的生产蛋白成本降低 |
| 一个宿主可以带有多个拷贝，表达效率高 | 能够对基因进行基因插入、基因敲除等编辑操作 |
Q5：细胞转染方法有哪些，技术原理是什么
A：如下表所示
| 转染方法 | 技术原理 |
| 磷酸钙法 | 磷酸钙 DNA 复合物吸附细胞膜被细胞内吞 |
| 电穿孔发 | 高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA 通过膜上形成的小孔导入 |
| 阳离子脂质体法 | 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞 |
| DEAE-右旋糖苷法 | 带正电的 DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成复合物被细胞内吞 |
| 病毒介导法 | 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 |
| 基因枪法 | 将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再用颗粒传递法将包被好的颗粒用弹道置投射入细胞，DNA 在胞内逐步释放，表达 |
Q6：如果瞬时表达的表达水平较低，通常如何调整实验方案来达到提高表达水平的目的？
A：一般来说，蛋白质的表达主要由蛋白自身特性决定。常用的优化方式有密码子的优化，改变信号肽，改变表达载体，克隆策略（如 Fc 标记），检测细胞裂解液以确定蛋白质是否分泌和表达，改变宿主细胞系,转染模式的优化，细胞培养方案优化，纯化步骤中的缓冲液筛选（沉淀，溶解度），添加蛋白酶抑制剂（如果存在蛋白降解现象）。