蛋白质印迹法

一、蛋白质印迹法

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
蛋白质印迹法是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。蛋白免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

二、原理
与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

（三）Western Blot显色的方法分类

1.放射自显影
2.底物化学发光ECL
3.底物荧光ECF
4.底物DAB呈色

（四）Western Blotting常见问题及解决方案

问题	原因	解决方案
胶不平	玻璃板不干净	胶板洗刷干净；
	催化剂或加速剂的量不合适	加入Ammonium persulphate和TEMED的量要合适；
	试剂未混均，致使部分胶块聚合不均匀	加入试剂后摇匀，使其充分混合；
	受热不均匀导致胶聚合不均匀	温度合适
凝胶漏液	玻璃板未对齐	两块玻璃板底部要对齐
条带比正常的窄	凝胶聚合不均匀	灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓；
	加样孔扭曲	拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲
“微笑”条带	样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一	纯化样品，调整盐浓度
“倒微笑”条带	胶板底部有气泡会影响电泳效果	应赶走胶板底部气泡，同时注意电泳槽装置是否合适
凝胶肿胀或卷曲	取出凝胶后暴露空气中过久	可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5~10min
条带歪斜或漂移	电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致	可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸
单个或多个白点	膜与胶块之间有气泡	确保膜和胶块之间没有气泡
转膜缓冲液过热	缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高	转膜过程注意降温
背景过高	膜没有均匀浸湿	转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿
	膜或者缓冲液污染	拿取膜与吸水纸时要戴手套
	封闭不充分	更换新鲜转膜缓冲液
	抗体与封闭剂出现交叉反应	检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应
	抗体浓度过高	杂交前检测一抗、二抗的工作浓度
	封闭时间与清洗时间过长	减少封闭或清洗时间
	上样量过大	合适的上样量
	压片时间过长	缩短压片时间