从动物免疫到高亲和力筛选：卡梅德单链抗体（scFv）噬菌体文库构建全流程！

我们需要制备出免疫原性好的靶标分子作为免疫原，免疫原的质量是得到优质抗体的关键，针对较难表达的免疫原蛋白，我们还可以制备腺病毒或腺相关病毒进行动物免疫；还可以提供mRNA包封LNP服务用作免疫原，此种方式可以实现蛋白体内表达并产生免疫反应，免去了蛋白体外表达的步骤，节约了研发成本及时间成本。

选择身体状态良好，免疫背景清楚的免疫动物进行免疫，免疫前需采取血清作为阴性对照，免疫方式为背部分散多点免疫，如果是病毒免疫需要进行肌肉注射，每两周进行一次。

将免疫后的羊驼血清进行效价检测，检测合格后会抽取120ml的羊驼全血，用淋巴细胞分离液进行PBMC的分离。

用无酶RNA提取试剂盒提取PBMC中的RNA，反转录成cDNA,再经PCR多轮扩增得到VH及VL序列。

单链抗体文库构建基于噬菌体展示技术（尤其是M13噬菌体展示技术），通过同源重组的方式将扩增的VH片段与VL片段通过scFv连接肽相连并克隆到噬菌体载体上，使得scFv抗体展示在噬菌体表面。免疫文库库容高达10^9-10^10，文库多样性>90%、插入率95%、阳性率>95%，当然scFv文库的序列也可以从天然或合成文库中获得，只不过相较于免疫文库，天然库和合成文库筛选到与靶标结合抗体的概率比较低，类似于“撞大运”，且其亲和力与特异性也是不能保证的。

文库筛选的方式有很多，大体分为固相、液相。固相筛选是将靶标固定到一个载体上（ELISA板或芯片）然后结合文库中的噬菌体；磁珠筛选属于液相筛选的一种，通常将靶标蛋白结合到磁珠上再与文库进行孵育；细胞筛选既可以用固相筛选的方式也可以用液相筛选的方式进行，与其他筛选方式的区别在于筛选源变为了细胞。先进行负向筛选再进行正向筛选为一轮，通常3-4轮就可以得到亲和力强且针对靶标分子的抗体序列，此噬菌体展示的序列组成了靶标分子的高特异性及亲和力的scFv抗体文库，后续此序列可以根据客户的实验需要进行抗体表达及改造。

根据下游实验的需要可以对抗体进行个性化定制，比如各种种属来源的IgG表达、各种种属的scFv抗体表达等。