原核表达载体

原核表达载体：能携带外源的目的基因进入原核细胞中，进行表达的载体。枯草芽孢杆菌表达载体、大肠杆菌表达载体和链霉菌表达载体是主要的三大原核表达载体。其中以大肠杆菌表达载体应用最广泛、发展得最成熟。主要原因是，大肠杆菌遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强。

 

大肠杆菌表达系统主要包括：宿主菌(即大肠杆菌)及表达载体。表达载体是在克隆载体的基础上，增加一些表达元件。除了具备复制能力、具有合适的酶切位点以及筛选标记外，还能够将外源目的基因引入到大肠杆菌中，并进行表达。

 

表达载体具有以下特征：①、稳定的遗传复制能力，在无选择压力下能稳定地存在于大肠杆菌内;②、具有显性的筛选标记;③、启动子的转录水平是可以调控的，未激活时本底转录水平较低;④、启动子所转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程不会影响表达载体的复制;⑤、具备适用于外源基因插人的酶切位点。

综上，原核蛋白表达载体质粒包括复制子(Replicon)、启动子(promoter)、筛选标签(selection marker)、终止子和核糖体结合位点多克隆位点（MCS）和融合蛋白移除策略(fusion tag removal strategy)，常见的原核表达载体pET-28a（+）、pGEX-4T-1、pET SUMO

 

原核表达载体的表达元件

①、启动子: 启动子在影响蛋白表达量上扮演重要角色，lac、 trp、tac、T7噬菌体启动子及IPL启动子是原核表达载体的主要启动子。 lac启动子被IPTG调控表达。lac杂合启动子被lac和trp组合而成，同样用IPTG来诱导，启动能力远超于lac和trp。色氨酸启动子trp被色氨酸诱导表达。T7噬菌体启动子具备有高度特异性，受控于T7 RNA聚合酶，T7 RNA聚合酶的活性远超过大肠杆菌聚合酶，因此可以高效表达目的基因。IPL启动子受温度的调控，活性大于trp。

②、转录终止子为了保持载体系统稳定，防止被克隆的外源基因表达干扰。将转录终止子插入到多克隆位点的下游。

③、核糖体结合位点mRNA转录完成后，为了能将目的蛋白完整翻译出来，需要借助宿主细胞的蛋白质合成系统。因此在插入的外源基因的mRNA上，必须存在宿主细胞核糖体的结合位点，从而起始密码子被启动翻译，蛋白质完成。

 

原核表达载体的表达方式

①、组成型表达 组成型启动子包括T7噬菌体启动子等，当目的基因受该类启动子的控制时，外源目的基因选择表达。产量高，但对一些宿主细胞有害的蛋白不推荐用，这是是组成型表达的特点。

②、诱导型表达lac及杂合启动子tac为IPTG诱导型启动子。trp作为色氨酸诱导型启动子。IPL是温度调控启动子，无论受到何种因素调控，诱导型启动子的表达可避免宿主前期生长受到不利影响，同时可减少表达产物被蛋白酶所降解，适合于有毒蛋白的表达。

③、融合型表达 表达载体的多克隆位点上存在多种融合表达标签，目的蛋白与标签共同表达为融合蛋白，有利于后续的蛋白分离纯化及检测。常见标签有GST标签SUMO标签及His标签。

④、分泌型表达 在起始密码与目的基因之间加信号肽，使得目的蛋白穿过细胞膜，分泌于胞外。除此之外，分泌出的表达产物一般是可溶性的，不存在复性步骤。

选择合适的表达载体，对于成功的表达目的蛋白至关重要，我们应结合目的基因的特点，对于蛋白的下游应用等，综合评估哪种载体进行重组蛋白的表达和方案设计。